在分離分析特別是蛋白質(zhì)分離分析中，層析是相當(dāng)重要、且相當(dāng)常見的一種技術(shù)，其原理較為復(fù)雜，對(duì)人員的要求相對(duì)較高，這里只能做一個(gè)相對(duì)簡單的介紹。

一、 吸附層析

1、 吸附柱層析

吸附柱層析是以固體吸附劑為固定相，以有機(jī)溶劑或緩沖液為流動(dòng)相構(gòu)成柱的一種層析方法。

2、 薄層層析

薄層層析是以涂布于玻板或滌綸片等載體上的基質(zhì)為固定相，以液體為流動(dòng)相的一種層析方法。這種層析方法是把吸附劑等物質(zhì)涂布于載體上形成薄層，然后按紙層析操作進(jìn)行展層。

3、 聚酰胺薄膜層析

聚酰胺對(duì)極性物質(zhì)的吸附作用是由于它能和被分離物之間形成氫鍵。這種氫鍵的強(qiáng)弱就決定了被分離物與聚酰胺薄膜之間吸附能力的大小。層析時(shí)，展層劑與被分離物在聚酰胺膜表面競爭形成氫鍵。因此選擇適當(dāng)?shù)恼箤觿┦狗蛛x在聚酰胺膜表面發(fā)生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的連續(xù)過程，就能導(dǎo)致分離物質(zhì)達(dá)到分離目的。

二、 離子交換層析

離子交換層析是在以離子交換劑為固定相，液體為流動(dòng)相的系統(tǒng)中進(jìn)行的。離子交換劑是由基質(zhì)、電荷基團(tuán)和反離子構(gòu)成的。離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應(yīng)主要以離子交換方式進(jìn)行，或借助離子交換劑上電荷基團(tuán)對(duì)溶液中離子或離子化合物的吸附作用進(jìn)行。`

三、 凝膠過濾

凝膠過濾又叫分子篩層析，其原因是凝膠具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，小分子物質(zhì)能進(jìn)入其內(nèi)部，而大分子物質(zhì)卻被排除在外部。當(dāng)一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時(shí)，溶液中的物質(zhì)就按不同分子量篩分開了。

四、 親和層析

親和層析的原理與眾所周知的抗原一抗體、激素一受體和酶一底物等特異性反應(yīng)的機(jī)理相類似，每對(duì)反應(yīng)物之間都有一定的親和力。正如在酶與底物的反應(yīng)中，特異的廢物(S')才能和一定的酶(E)結(jié)合，產(chǎn)生復(fù)合物(E－S')一樣。在親和層析中是特異的配體才能和一定的生命大分子之間具有親和力，并產(chǎn)生復(fù)合物。而親和層析與酶一底物反應(yīng)不同的是，前者進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，配體(類似底物)是固相存在；后者進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，底物呈液相存在。實(shí)質(zhì)上親和層析是把具有識(shí)別能力的配體L(對(duì)酶的配體可以是類似底物、抑制劑或輔基等)以共價(jià)鍵的方式固化到含有活化基團(tuán)的基質(zhì)M(如活化瓊脂糖等)上，制成親和吸附劑M－L，或者叫做固相載體。而固化后的配體仍保持束縛特異物質(zhì)的能力。因此，當(dāng)把圍相載體裝人小層析柱(幾毫升到幾十毫升床體積)后，讓欲分離的樣品液通過該柱。這時(shí)樣品中對(duì)配體有親和力的物質(zhì)S就可借助靜電引力、范德瓦爾力，以及結(jié)構(gòu)互補(bǔ)效應(yīng)等作用吸附到固相載體上，而無親和力或非特異吸附的物質(zhì)則被起始緩沖液洗滌出來，并形成了第一個(gè)層析峰。然后，恰當(dāng)?shù)馗淖兤鹗季彌_ 液的PH值、或增加離子強(qiáng)度、或加人抑③劑等因子，即可把物質(zhì)S從固相載體上解離下來，并形成了第M個(gè)層析峰(見圖6－2)。顯然，通過這一操作程序就可把有效成分與雜質(zhì)滿意地分離開。如果樣品液中存在兩個(gè)以上的物質(zhì)與固相載體具有親和力(其大小有差異)時(shí)，采用選擇性緩沖液進(jìn)行洗脫，也可以將它們分離開。用過的固相載體經(jīng)再生處理后，可以重復(fù)使用。

上面介紹的親和層析法亦稱特異性配體親和層析法。除此之外，還有一種親和層析法叫通用性配體親和層析法。這兩種親和層析法相比，前者的配體一般為復(fù)雜的生命大分子物質(zhì)(如抗體、受體和酶的類似底物等)，它具有較強(qiáng)的吸附選擇性和較大的結(jié)合力。而后者的配體則一般為簡單的小分子物質(zhì)(如金屬、染料，以及氨基酸等)，它成本低廉、具有較高的吸附容量，通過改善吸附和脫附條件可提高層析的分辨率。

五、 聚焦層析

聚焦層析也是一種柱層析。因此，它和另外的層析一樣，照例具有流動(dòng)相，其流動(dòng)相為 多緩沖劑，固定相為多緩沖交換劑。

聚焦層析原理可以從PH梯度溶液的形成、蛋白質(zhì)的行為和聚焦效應(yīng)三方面來闡述。

1、PH梯度溶液的形成

在離子交換層析中，PH梯度溶液的形成是靠梯度混合儀實(shí)現(xiàn)的。例如，當(dāng)使用陰離子 劑進(jìn)行層析時(shí)，制備PH由高到低呈線性變化的梯度溶液的方法是，在梯度儀的混合室(這層析柱者)中裝高PH溶液，而在另一室裝低PH極限溶液，然后打開層析柱的下端出口，讓洗脫液連續(xù)不斷地流過柱體。這時(shí)從柱的上部到下部溶液的PH值是由高到低變化的。而在聚焦層析中，當(dāng)洗脫液流進(jìn)多緩沖交換劑時(shí)，由于交換劑帶具有緩沖能力的電荷基團(tuán)，故PH梯度溶液可以自動(dòng)形成。例如，當(dāng)柱中裝陰離子交換劑PBE94(作固定相)時(shí)，先用起始緩沖液(配方見表了一2)平衡到PHg，再用含PH6的多緩沖劑物質(zhì)(作流動(dòng)相)的淋洗液通過柱體，這時(shí)多緩沖劑中酸性最強(qiáng)的組分與堿性陰離子交換對(duì)結(jié)合發(fā)生中和作用。隨著淋洗液的不斷加人，住內(nèi)每點(diǎn)的PH值從高到低逐漸下降。照此處理J段時(shí)間，從層析柱頂部到底部就形成了PH6～9的梯度。聚焦層析柱中的PH梯度溶液是在淋洗過程中自動(dòng)形成的，但是隨著淋洗的進(jìn)行，PH梯度會(huì)逐漸向下遷移，從底部流出液的PH卻由9逐漸降至6，并最后恒定于此值，這時(shí)層析柱的PH梯度也就消失了。

2．蛋白質(zhì)的行為

蛋白質(zhì)所帶電荷取決于它的等電點(diǎn)(PI)和層析柱中的PH值。當(dāng)柱中的PH低于蛋白質(zhì)的PI時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷，且不與陰離于交換劑結(jié)合。而隨著洗脫劑向前移動(dòng)，固定相中的PH值是隨著淋洗時(shí)間延長而變化的。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)移動(dòng)至環(huán)境PH高于其PI時(shí)，蛋白質(zhì)由帶正電行變?yōu)閹ж?fù)電荷，并與陰離子交換劑結(jié)合。由于洗脫劑的通過，蛋白質(zhì)周圍的環(huán)境PH 再次低于PI時(shí)，它又帶正電荷，并從交換劑解吸下來。隨著洗脫液向柱底的遷移，上述過程將反復(fù)進(jìn)行，于是各種蛋白質(zhì)就在各自的等電點(diǎn)被洗下來，從而達(dá)到了分離的目的。

不同蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，它們在被離子交換劑結(jié)合以前，移動(dòng)之距離是不同的，洗脫出來的先后次序是按等電點(diǎn)排列的。

供靜脈注射的25%人胎盤血白蛋白（即胎白）通常是用硫酸銨鹽析法、透析脫鹽、真空濃縮等工藝制備的，該工藝流程硫酸銨耗量大，能源消耗多，操作時(shí)間長，透析過程易產(chǎn)生污染。改用超濾工藝后，平均回收率可達(dá)97.18%；吸附損失為1.69%；透過損失為1.23%；截留率為98.77%。大幅度提高了白蛋白的產(chǎn)量和質(zhì)量，每年可節(jié)省硫酸銨6.2噸，自來水16000噸。目前國外生產(chǎn)超濾膜和超濾裝置最有名的廠家是美國的Milipore公司和德國的Sartorius公司。

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展, 通過基因工程生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物在治療人類面臨的重大疾病如癌癥等方面展示出巨大的潛力. 為滿足生物技術(shù)產(chǎn)品工業(yè)化生產(chǎn)的需要, 開發(fā)高通量、低成本、高效的分離純化方法已引起人們的高度關(guān)注. 超濾技術(shù)由于具有通量高, 操作條件溫和, 易于放大等特點(diǎn), 特別適合生物活性大分子的分離. 在生物技術(shù)領(lǐng)域, 超濾技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞收集分離、除菌消毒、緩沖液置換、分級(jí)( fract ionatio n) 、脫鹽及濃縮[ 1] . 近年來越來越多的研究表明, 通過選擇適當(dāng)?shù)哪せ蚰け砻娓男?以及對(duì)分離過程進(jìn)行優(yōu)化, 充分利用和調(diào)控膜—蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)之間的靜電相互作用, 可以實(shí)現(xiàn)分子量相近的兩種蛋白質(zhì)的高選擇性超濾分離[2- 7] .

為克服常規(guī)蛋白質(zhì)超濾分離過程優(yōu)化中存在的實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)消耗多、工作量大、費(fèi)時(shí)以及費(fèi)用高等缺點(diǎn), 我們相繼開發(fā)了脈沖進(jìn)樣技術(shù)( Pulsed sampleinject ion technique ) [8]和參數(shù)連續(xù)變化超濾技術(shù)( Parameter scanning ultraf ilt ration) [9]. 并以此為基礎(chǔ), 結(jié)合載體相超濾技術(shù)( Carrier phase ult rafil—t rat ion) [10]進(jìn)一步提出了一種蛋白質(zhì)超濾分離快速優(yōu)化新方法[11], 實(shí)現(xiàn)了人血漿白蛋白—免疫球蛋白[12]、人源化單克隆抗體( A lemtuzumab) 單體— 二聚體[13]的超濾分離過程快速優(yōu)化和高選擇性分離,并在膜的篩選及其適用性快速評(píng)估方面展現(xiàn)出巨大的潛力. 該方法的主要特征是與AKTA Prime 系統(tǒng)聯(lián)用, 采用脈動(dòng)進(jìn)樣技術(shù)顯著減少了蛋白質(zhì)的用量;而利用雙緩沖體系( 類似梯度洗脫) 的參數(shù)連續(xù)變化超濾技術(shù), 在pH 或離子強(qiáng)度連續(xù)變化的情況下考查pH 或離子強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)透過率或截留率的影響, 進(jìn)一步縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間, 降低了蛋白質(zhì)的用量,極大地減少了實(shí)驗(yàn)量, 加快了過程優(yōu)化進(jìn)程; 另外,載體相超濾技術(shù)的應(yīng)用則可保證超濾分離自始至終在設(shè)定的條件下進(jìn)行, 從而最大限度地保證超濾過程的穩(wěn)定性.

標(biāo)簽：層析超濾蛋白質(zhì)