測(cè)定蛋白質(zhì)的方法可分為兩大類(lèi)：一類(lèi)是利用蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)來(lái)推算，如密度、折射率、紫外吸收、熒光性等；另一類(lèi)是利用化學(xué)方法來(lái)計(jì)算，如定氮、雙縮脲反應(yīng)、染料結(jié)合反應(yīng)、酚試劑反應(yīng)等 主要測(cè)定方法有：雙縮脲法、染料結(jié)合法、酚試劑法、紫外分光光度法、水揚(yáng)酸比色法、折光法、旋光法、近紅外光譜法. 目前蛋白質(zhì)測(cè)定最常用的方法是凱氏定氮法，是通過(guò)測(cè)總氮量來(lái)確定蛋白質(zhì)含量的方法。 凱氏定氮法是通過(guò)測(cè)出樣品中的總含氮量再乘以相應(yīng)的蛋白質(zhì)系數(shù)而求出蛋白質(zhì)的含量,此法的結(jié)果稱為粗蛋白質(zhì)含量：由于樣品中含有少量非蛋白質(zhì)含氮化合物，如核酸、生物堿、含氮類(lèi)脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白質(zhì)的含氮化合物.凱氏定氮法是測(cè)定總有機(jī)氮量較為準(zhǔn)確、操作較為簡(jiǎn)單的方法之一，可用于所有動(dòng)、植物食品的分析及各種加工食品的分析，可同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣品，故國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較為普遍，是個(gè)經(jīng)典分析方法[6]。至今仍被作為標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法.此法可應(yīng)用于各類(lèi)食品中蛋白質(zhì)含量測(cè)定 凱氏定氮法可分為全量法、微量法及經(jīng)改進(jìn)后的改良凱氏定氮法目前通常以硫酸銅作催化劑的常量、半微量、微量凱氏定氮法樣品質(zhì)量及試劑用量較少，且有一套微量凱氏定氮器。在凱氏法改良中主要的問(wèn)題是，氮化合物中氮的完全氨化問(wèn)題及縮短時(shí)間、簡(jiǎn)化操作的問(wèn)題，即分解試樣所用的催化劑。常量改良凱氏定氮法在催化劑中增加了二氧化鈦[4]. 在理化實(shí)驗(yàn)室,檢驗(yàn)食品中蛋白質(zhì)的含量通常用微量凱氏定氮法和全量凱氏定氮法.接下來(lái)以大量的試驗(yàn)來(lái)比較微量凱氏定氮法和全量凱氏定氮法的精確度的大小. 1.材料與方法： 1.1試驗(yàn)材料 1.1.1試驗(yàn)樣品 面粉 1.1.2試驗(yàn)藥品和試劑 所有試劑均為分析純；水為蒸餾水或同等純度的水。 硫酸銅； 硫酸鉀； 濃硫酸； 40％氫氧化鈉溶液：稱取40g氫氧化鈉溶于60mL蒸餾水中； 4％硼酸溶液：稱取4g硼酸溶于蒸餾水中稀釋至lOOmL； 0．1mol／L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液； 甲基紅次甲基藍(lán)混合指示液：將次甲基藍(lán)乙醇溶液(1g／L)與甲基紅乙醇溶液(1g／L)按1+2體積比混合。 1.1.3儀器和設(shè)備： 實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器及下列各項(xiàng)： 凱氏燒瓶：500mL； 可調(diào)式電爐；蒸汽蒸餾裝置； 鉸肉機(jī)： 篦孔徑不超過(guò)4nm； 組織搗碎機(jī)； 粉碎機(jī)； 研缽：玻璃或瓷質(zhì)； 化學(xué)消化器， 凱氏定氮儀， 空氣濾過(guò)器 1.2試驗(yàn)方法 1.2.1微量凱氏定氮法 微量凱氏定氮法的原理 樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后取消化液的1/10加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸或硫酸溶液滴定[2]。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。包括消化、蒸餾、吸收、滴定四個(gè)步驟 1.2.2全量凱氏定氮法 全量凱氏定氮法的原理 樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后取消化液的全部加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸或硫酸溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。包括消化、蒸餾、吸收、滴定四個(gè)步驟 2 分析過(guò)程 試樣制備：固體樣品：取有代表性的樣品至少200g，用研缽搗碎、研細(xì)；不易搗碎、研細(xì)的樣品應(yīng)切(剪)成細(xì)粒；干固體樣品用粉碎機(jī)粉碎；液體樣品：取充分混勻的液體樣品至少200g。粉狀樣品：取有代表性的樣品至少200g(如粉粒較大也應(yīng)用研缽研細(xì))，混合均勻；糊狀樣品：取有代表性的樣品至少200g，混合均勻；固液體樣品：按固、液體比例，取有代表性的樣品至少200g，用組織搗碎機(jī)搗碎，混合均勻；肉制品：取去除不可食部分、具有代表性的樣品至少200g，用鉸肉機(jī)至少鉸兩次，混合均勻。上述試樣應(yīng)放入密閉玻璃容器中，于4°C冰箱內(nèi)貯存?zhèn)溆茫M快測(cè)定。 2.1微量凱氏定氮法的分析過(guò)程 2.1.1樣品消化 : 步驟：準(zhǔn)確稱取一定量的樣品，加入硫酸銅0.5g、硫酸鉀10g和濃硫酸20mL、玻璃珠數(shù)粒→小心移入干燥潔凈的500ml凱氏燒瓶中(固體或粉末用紙卷成紙筒送入)，輕輕搖勻，以45o斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上→用電爐以小火加熱(或先燒瓶放在距電爐較遠(yuǎn)處)，待內(nèi)容物全部炭化、泡沫停止產(chǎn)生后→加大火力(或?qū)糠旁陔姞t上)，保持瓶?jī)?nèi)液體微沸→至液體變藍(lán)綠色透明后→繼續(xù)加熱微沸30min→關(guān)閉電爐，取下燒瓶、冷卻→轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，加水定容 2.1.2 蒸餾與吸收： 按圖安裝好微量定氮蒸餾裝置。于水蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)裝水至2/3容積處，加甲基橙指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)毫升，以保持水呈酸性，加入數(shù)粒玻璃珠。在接受瓶中加入10ml40g/L硼酸及2滴混合指示劑，將冷凝管下端插入液面以下。準(zhǔn)確吸取消化液10mL于反應(yīng)管內(nèi)，經(jīng)漏斗再加入10mL氫氧化鈉溶液，用少量蒸餾水沖洗漏斗，夾好漏斗夾并水封，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)的水進(jìn)行蒸餾。指示劑變綠色后繼續(xù)蒸餾10min，將冷凝管尖端提離液面繼續(xù)蒸1min

標(biāo)簽：測(cè)定步驟關(guān)鍵