第3章 分子生物學(xué)實驗基本操作技術(shù)

這里的實驗基本操作技術(shù)是指在分子生物學(xué)實驗中使用范圍最廣、使用頻率最高、幾乎所有實驗都要應(yīng)用的技術(shù)。器皿的清洗，試管、量筒（杯）、容量瓶、吸管及移液器、電子天平等量具的正確操作和使用、試劑配制等技術(shù)，應(yīng)當(dāng)都是基本操作技術(shù)，但這些內(nèi)容已在分析化學(xué)、生物化學(xué)的實驗課程中作了詳細(xì)介紹。本章主要介紹與分子生物學(xué)實驗有關(guān)的除（滅）菌技術(shù)、無菌操作技術(shù)和微量操作技術(shù)。
3.1 除(滅)菌技術(shù)
在進(jìn)行分子生物學(xué)實驗過程中，需要一個清潔的實驗環(huán)境，所使用的器皿及溶液均需要進(jìn)行除（滅）菌處理，一方面避免環(huán)境中微生物的污染，另一方面還可消除蛋白酶和核酸酶對實驗的干擾和影響。在進(jìn)行微生物及細(xì)胞的純培養(yǎng)時要求更高，不能有任何外來雜菌。因此，對所有器材、培養(yǎng)基要進(jìn)行嚴(yán)格滅菌，對工作場所進(jìn)行消毒，保證工作順利進(jìn)行。
實驗室常用的除滅菌方法主要有物理方法及化學(xué)方法兩種。物理方法包括用濕熱（高壓蒸汽）、干熱、紫外線、過濾、離心沉淀等方法除去微生物；化學(xué)方法是使用化學(xué)消毒劑、抗菌素等殺死或抑制微生物。根據(jù)被滅菌物品的材料性質(zhì)和實驗要求，可采取不同的消毒滅菌方法。
3.1.1 物理滅菌法
（1）干熱滅菌：干熱滅菌包括火焰灼燒滅菌和熱空氣滅菌。
火焰灼燒適用于金屬用具，如接種環(huán)、接種針和手術(shù)器械等，玻璃器皿的口頸，如試管口和瓶口，玻璃棒等的滅菌處理。這種方法滅菌迅速徹底。
熱空氣滅菌一般在烤箱中進(jìn)行，利用高溫干燥空氣（160℃?170℃）加熱滅菌1?2h，適用于玻璃器皿和培養(yǎng)皿等。干熱消毒后的器皿干燥，易于保存。缺點是干熱傳導(dǎo)慢，可能有冷空氣存留于烤箱內(nèi)，因此要求較高的溫度和較長的時間才能達(dá)到消毒的目的。應(yīng)當(dāng)注意，干烤滅菌完畢后不得馬上將烤箱門打開，須等溫度降至70℃以下時再開箱門，以免冷空氣突然進(jìn)入，影響消毒效果和損壞玻璃器皿或發(fā)生意外事故。在滅菌時，物品不能放的太擠。滅菌的玻璃器皿中不可有水，有水的玻璃器皿在干熱滅菌時容易炸裂。培養(yǎng)基、橡膠制品、塑料制品不能用此方法消毒。
（2）濕熱滅菌：在相同溫度下，濕熱的滅菌效力比干熱滅菌好。原因是：（1）熱蒸汽對細(xì)胞成分的破壞作用更強。水分子的存在有助于破壞維持蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的氫鍵和其他相互作用弱鍵，更易使蛋白質(zhì)變性。加熱使蛋白質(zhì)變性，與水的含量有關(guān)，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞含水量越大，凝固越快。蛋白質(zhì)含水量與其凝固溫度成反比；（2）熱蒸汽比熱空氣穿透力強，能更有效地殺滅微生物；（3）蒸汽存在潛能，當(dāng)氣體轉(zhuǎn)變成液體時可放出大量熱能，故可更迅速提高滅菌物體的溫度。
濕熱滅菌常用的方法有高壓蒸汽滅菌、常壓蒸汽滅菌和煮沸滅菌。其中高壓蒸汽滅菌法最為常用，效果最好。常壓蒸汽滅菌法不能在短時間內(nèi)殺死細(xì)菌芽孢，必須采取間歇滅菌或持續(xù)滅菌的方法，才能達(dá)到完全滅菌。而煮沸滅菌僅用于注射器及某些用具的滅菌，被滅菌物品的濕度太大。所以，這兩種方法較少使用。
高壓蒸氣滅菌是在密閉的高壓蒸汽鍋中進(jìn)行的。其原理是：將待滅菌的物體放置在盛有適量水的高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，將鍋內(nèi)的水加熱煮沸，并把其中原有的冷空氣徹底驅(qū)盡后將鍋密閉，再繼續(xù)加熱就會使鍋內(nèi)的蒸汽壓逐漸上升，從而使溫度也隨之上升到100℃以上。
滅菌時，根據(jù)不同的物品選擇不同壓力和時間，一般物品（如布類、金屬器械、玻璃器皿等）消毒的要求是0.15MPa下15min，培養(yǎng)液和橡膠制品為0.1MPa下10min。滅菌前在鍋內(nèi)加適量的水，加水過少，易將滅菌鍋燒干，引起炸裂事故。加水過多有可能引起滅菌物品浸水。物品不能裝得過滿，以免影響消毒器內(nèi)氣體流通。導(dǎo)氣管要伸至罐底并防止堵塞。在加熱升壓之前，先要打開排氣閥門排放消毒器內(nèi)的冷空氣，冷空氣排出后，關(guān)閉排氣閥門，同時檢驗安全閥活動自如，開始升壓，當(dāng)達(dá)到所需壓力時，開始計時，并控制壓力恒定。滅菌過程中，操作者不能離開工作崗位，要定時檢查壓力及安全，防止意外事件發(fā)生。滅菌完畢后一定要先打開閥門放氣，當(dāng)滅菌鍋內(nèi)壓力下降到“0”時，再打開滅菌鍋的蓋。也可在滅菌完畢后，關(guān)閉電源總閥，讓滅菌物品自然冷卻，待滅菌鍋壓力表降至“0”時，再取出滅菌物品。

蒸汽壓力與溫度的關(guān)系
蒸汽壓力（表壓） 蒸汽溫度
Kg/cm2 MPa ℃ ℉
0.00 0.00 100 212
0.25 0.025 107.0 224
0.50 0.050 112.0 234
0.75 0.075 115.5 240
1.00 0.100 121.0 250
1.50 0.150 128.0 262
2.00 0.200 134.5 274

（3）紫外線殺菌： 紫外線的波長范圍是200?300nm，殺菌范圍為240?280nm，其中波長在260nm左右的紫外線殺菌作用最強。紫外燈是人工制造的低壓水銀燈，能輻射出257.3nm的紫外線，殺菌能力強且較穩(wěn)定。紫外線殺菌作用是因為它可以被蛋白質(zhì)（波長為280nm）和核酸（波長為260nm）吸收，造成這些分子的變性失活。紫外線穿透能力很差，不能穿透玻璃、衣物、紙張和大多數(shù)其他物體，但能穿透空氣，主要用于實驗室空氣、操作臺表面和不能使用其它方法進(jìn)行滅菌的物品。紫外線直接照射方便、效果好，經(jīng)一定的時間照射后，可以消滅空氣中大部分細(xì)菌。培養(yǎng)室紫外線燈應(yīng)距地面不超過2.5米，且消毒物品不宜相互遮擋，照射不到的地方起不到消毒作用。
紫外線照射可產(chǎn)生臭氧，污染空氣，對試劑及培養(yǎng)液都有不良影響，對人皮膚也有傷害。
（4）過濾除菌：很多液體不能采用高壓滅菌的方法進(jìn)行滅菌處理，如血清、合成培養(yǎng)液、酶及含有生物活性蛋白的液體等，可采用過濾的方法除去細(xì)菌等微生物。濾器有抽吸（抽濾）式及加壓式兩種類型；濾板（或濾膜）結(jié)構(gòu)可分為石棉板、玻璃或微孔膜。常用的濾器有Zeiss濾器（蔡氏濾器）、玻璃濾器和微孔濾膜濾器，其中微孔濾膜濾器最為常用。
微孔濾膜濾器多為塑料結(jié)構(gòu)，分為上下兩部分，中間可放置纖維素濾膜。將待過濾液體吸入注射器內(nèi)，慢慢注入濾器上部的孔中，通過中間的濾膜即可。可用于包括血清在內(nèi)的各種培養(yǎng)液的過濾除菌，速度快，效果好。濾膜為一次性的特制混合纖維素濾膜，其孔徑有0.6μm、0.45μm、0.22μm三種，用于過濾除菌時，最好選用0.22μm的濾膜（可以除去細(xì)菌和霉菌）。安裝濾膜時要注意：先將濾膜在蒸餾水中浸濕再安裝；濾膜薄且光滑，容易移動，千萬不能裝偏而使過濾失敗；同時要注意濾膜的正反面，正面（光面）應(yīng)朝上。由于濾膜薄，承受壓力有限，壓力不能過大、過猛，以免造成濾膜破裂。每次過濾后應(yīng)打開濾器，核實濾膜是否移動和破裂，以保證有效過濾除菌。微孔濾膜濾器的清洗、消毒方法很簡單，用完后去掉濾膜，用去離子水沖洗干凈，再將新的濾膜正確放入其中，包裹后可高壓滅菌處理，也可直接煮沸滅菌處理。現(xiàn)在也有一次性小濾器。
3.1.2 化學(xué)滅菌法
應(yīng)用化學(xué)制劑破壞細(xì)菌代謝機能。常用化學(xué)殺菌劑有：乙醇、醋酸、福爾馬林、高錳酸鉀、新潔爾滅等。最常見的是75%酒精及1‰的新潔爾滅，前者主要用于操作者的皮膚，操作臺表面及無菌室內(nèi)的壁面處理。后者則主要用于器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦試消毒。化學(xué)滅菌法操作簡單、方便有效。
將高錳酸鉀粉末與適量體積的福爾馬林混合，會產(chǎn)生大量的甲醛氣體，常用于無菌室的熏蒸消毒。
3.1.3抗生素滅菌法
主要用于培養(yǎng)用液滅菌或預(yù)防培養(yǎng)物污染。要注意不能完全依賴抗生素來達(dá)到消毒滅菌的目的，還應(yīng)嚴(yán)格無菌操作。常用的抗生素是青霉素和鏈霉素。
3.2無菌操作技術(shù)
無菌技術(shù)是指實驗過程中，防止一切微生物侵入機體和保持無菌物品及無菌區(qū)域不被污染的操作技術(shù)和管理方法，是實驗過程中預(yù)防和控制交叉污染的一項重要基本操作。在生化實驗中經(jīng)常涉及到無菌操作技術(shù)，尤其是微生物的純培養(yǎng)、細(xì)胞及胚胎的培養(yǎng)，更需要嚴(yán)格的無菌操作技術(shù)。在無菌操作過程中，任何一個環(huán)節(jié)都不得違反操作原則，否則就可能造成實驗失敗。因此，必須加強無菌觀念，準(zhǔn)確熟練地掌握無菌技術(shù)，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程。
無菌技術(shù)包括四部分內(nèi)容：實驗所用的玻璃、塑料制品及金屬器械的處理；實驗操作對象及試劑的無菌處理；工作環(huán)境及表面的處理；實驗者的操作技術(shù)。前兩部分已在前面介紹過，這里主要介紹后兩部分內(nèi)容。
1. 周密計劃 在開始實驗前要制定好實驗計劃和操作程序。有關(guān)數(shù)據(jù)的計算要事先做好。
2．仔細(xì)準(zhǔn)備 根據(jù)實驗要求，準(zhǔn)備各種所需的器材和物品，并選擇適宜的方法進(jìn)行包裝和除（滅）菌處理，清點無誤后將其放置操作場所(培養(yǎng)室、超凈工作臺)內(nèi)。這樣可以避免開始實驗后因物品不全往返拿取而增加污染機會。
3．嚴(yán)格操作
實驗進(jìn)行前，無菌室及超凈工作臺以紫外燈照射30?60min滅菌，以70%酒精擦拭無菌操作臺面，并開啟無菌操作臺風(fēng)機運轉(zhuǎn)10min后，再開始實驗操作。實驗操作應(yīng)在超凈工作臺的中央無菌區(qū)域，不要在邊緣的非無菌區(qū)域操作。
為拿取方便，工作臺面上的用品要有合理的布局，原則上應(yīng)是右手使用的東西放置在右側(cè)，左手用品在左側(cè)，酒精燈置于中央。
在利用超凈臺工作時，因整個前臂要伸入箱內(nèi)，應(yīng)著長袖的清潔工作服，并于開始操作前要用75％酒精擦手或用消毒液洗手。如果實驗過程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手。進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)室需徹底洗手，戴口罩、著消毒衣帽及鞋等。
在無菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)或做其它無菌工作時，首先要點燃酒精燈或煤氣燈。以后一切操作，如安裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行。但要注意：金屬器械不能在火焰中燒的時間過長，以防退火，燒過的金屬鑷要待冷卻后才能夾取組織，以免造成組織損傷。吸取過營養(yǎng)液后的吸管不能再用火焰燒灼，因殘留在吸管頭中營養(yǎng)液能燒焦形成炭膜，再用時會把有害物帶入營養(yǎng)液中。開啟、關(guān)閉長有細(xì)胞或微生物的培養(yǎng)瓶時，火焰滅菌時間要短，防止因溫度過高燒死細(xì)胞或微生物。另外膠塞過火焰時也不能時間長，以免燒焦產(chǎn)生有毒氣體，危害培養(yǎng)細(xì)胞。進(jìn)行無菌操作時，動作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動，增加污染機會。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備用品更換。
工作由始至終要保持一定順序性，組織或細(xì)胞在未做處理之前，勿過早暴露在空氣中。同樣，培養(yǎng)用液及其他溶液在未用前，不要過早開瓶；打開瓶蓋進(jìn)行操作時，瓶口朝上與臺面呈45度角，減少落菌機會；用過之后如不再重復(fù)使用，應(yīng)立即封閉瓶口。吸取營養(yǎng)液、PBS緩沖液、細(xì)胞懸液及其它各種用液時，均應(yīng)分別使用吸管，不能混用，以防影響試劑的效果、擴大污染或?qū)е录?xì)胞交叉污染。工作中不能面向操作臺講話或咳嗽，以免唾沫把細(xì)菌或支原體帶入工作臺面發(fā)生污染。手或相對較臟的物品不能經(jīng)過開放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液時如吸管尖部碰到瓶口，則應(yīng)更換干凈吸管。
對于微生物或細(xì)胞而言，每次操作只處理一種微生物或一個細(xì)胞株，即使培養(yǎng)基相同也不要共享培養(yǎng)基，以免微生物或細(xì)胞間污染。
4．善始善終 實驗完畢后，應(yīng)及時將實驗物品及廢液帶出工作臺，關(guān)閉風(fēng)機，以70%酒精擦拭無菌操作臺面，關(guān)閉超凈工作臺的風(fēng)機和照明燈，實驗結(jié)束。盡管每次實驗前都會進(jìn)行工作臺面的消毒處理，但建議實驗結(jié)束后立即打開紫外燈進(jìn)行消毒，特別是在夏季，以防細(xì)菌或霉菌孳生。
無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其他實驗用品用完即取出，以利于空氣流通。
3.3微量操作技術(shù)
在過去的實驗中，大家使用的重量和體積計量單位主要是克（g）和毫升（ml）及其以上者，而小于g和ml的單位如毫克（mg）、微克（?g）及微升（?l）等極少用到。從進(jìn)入分子生物學(xué)實驗開始，這些很小的計量單位都將經(jīng)常使用，甚至更小者如納克（ng）、皮克（pg）及納升（nl）等也將用到。由相對宏觀的操作突然轉(zhuǎn)為微量操作，對初學(xué)者來講需要有一個熟悉并熟練的過程，關(guān)鍵應(yīng)當(dāng)注意以下幾個方面的問題。
1. 熟悉并掌握微量稱量器具的正確使用方法。微量電子天平（最小感量10-4g）和微量移液器（最大2?l）是兩種最常使用的器具，它們的使用方法請參考第2章有關(guān)內(nèi)容。準(zhǔn)確量取是微量操作的第一步，也是最重要的一步。
2. 添加。將一種或幾種液體物質(zhì)分別準(zhǔn)確量取后添加到同一個Eppendorf管中，必須保證看到每一種液體都加入其中，而且在取出移液器時，Tip頭的尖部不得帶出任何可見的液珠。
3. 混勻并集中。全部液體加完后，總體積只有10到幾十微升，難以用常規(guī)混勻的方法將各種成分徹底混勻。微量混勻的方法有：旋渦震蕩混勻和彈勻。將盛有液體的Eppendorf管蓋緊，握緊并將其底部與旋渦震蕩器接觸，液體會在管內(nèi)高速旋轉(zhuǎn)而混勻；也可手持蓋好的Eppendorf管上端（口部），另一只手反復(fù)彈動其底部，將其中的液體混勻。最后，用高速臺式離心機將全部液體甩到Eppendorf管的底部。
4. 有時將極微量的物質(zhì)如DNA片段或質(zhì)粒DNA溶解在幾微升液體中，盡管看不見待溶解物質(zhì)，但將液體加入后，用上述同樣的方法進(jìn)行操作，也可很好將其溶解并混勻。
5. 由于微量操作，實驗結(jié)果很難用肉眼直接觀察到。為了保證實驗的順利進(jìn)行，在分子生物學(xué)實驗過程中，每一步實驗的結(jié)果都必須利用相關(guān)的檢測、鑒定方法顯示出來，判定正確后再進(jìn)行下一步反應(yīng)。這是所有科學(xué)實驗的共同要求，但在分子生物學(xué)實驗中更應(yīng)當(dāng)強調(diào)和加以注意。

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